RESUMO
Antimicrobial peptides (AMPs) are components of innate immune system, are present in all living organisms, acting quickly and in unspecific way as a chemical barrier and they have antimicrobial activity. β-defensins is a major family of AMPs with characteristic β- sheet-rich fold, six conserved Cys with particular spacing and intramolecular bonds. They are extensively studied in mammals but scarcely in snakes. The β-defensin Defb-Lm02, of Lachesis muta snake, is codified by a gene structured in three exons and has 38 amino acid residues, molecular weight of 4.6 kDa, net charge of +8 at pH 7 and isoelectric point (pI) of 10.35. The synthetic linear peptide of Defb-Lm02 was tested to antimicrobial activity: it presented the minimum inhibitory concentration against Gram negative bacteria: Escherichia coli 16 μg/mL and Citrobacter freundii 16 μg/mL; and Gram positive: Micrococcus luteus 4 μg/mL and Staphylococcus aureus 32 μg/mL. It did not inhibit the growth of Gram-negative Klebsiella pneumonia, Serratia marcescens, Providencia rettgeri and Morganella morganii until the concentration of 64 μg/mL. These results may be due to the linearity of synthetic peptide. As the defense tasks of β-defensin could be dependent on their 3D structure, the production of recombinant β-defensin may potentiate its antimicrobial activity or suggest a new function. The synthetic gene, maltose binding protein (MBP) – TEV protease recognition site – DefbLm02, was cloned into the pET28a expression vector. The protein was expressed in E. coli BL21 Star and C43, at two temperatures 30 ° C and 37 ° C. After 4 hours of induction with IPTG 1 mM, which showed the best condition of expression was BL21 Star at 30 °C. The major part of fusion protein was soluble after purification by affinity chromatography and after proteolysis. The protein fusion was checked by Western blot using an antibody anti-MBP.
Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) fazem parte do sistema imune inato, presente em praticamente todas as formas de vida, age de maneira rápida e inespecífica, como uma barreira química e possuem atividade antimicrobiana. As β-defensinas são uma importante família de PAMs com características ricas em folhas β, seis Cys conservadas com espaçamento particular e ligações intramoleculares, são extensivamente estudadas em mamíferos, mas raramente em serpentes, e podem refletir uma adaptação de peptídeos de defesa epitelial do hospedeiro. A Defb-Lm02, uma defensina da serpente Lachesis muta, é codificada por um gene estruturado em três exons cuja tradução ao peptídeo maduro consiste em 38 resíduos de aminoácidos, massa molecular de 4,6 kDa, carga líquida de +8 em pH 7, ponto isoelétrico (pI) de 10,35. Esse peptídeo foi sintetizado na forma linear e testado para atividade antimicrobiana, resultando nas seguintes concentrações inibitórias mínima contra bactérias Gram negativa: Escherichia coli 16 μg/mL e Citrobacter freundii 16 μg/mL; contra Gram positiva: Micrococcus luteus 4 μg/mL e Staphylococcus aureus 32 μg/mL. Não inibiu o crescimento das bactérias Gram-negativas Klebsiella pneumonia, Serratia marcescens, Providencia rettgeri e Morganella morganii até a concentração de 64 μg/mL. Estes resultados podem ser devido à linearidade do peptídeo sintético. Sabemos que algumas atividades biológicas das β-defensinas são dependentes da sua estrutura 3D, portanto, a obtenção dessa toxina na forma recombinante pode potencializar sua atividade antimicrobiana ou até sugerir novas funções. O gene sintético, codificando a fusão proteína de ligação à maltose (MBP) - sítio de reconhecimento da protease TEV – DefbLm02, foi clonado no vetor de expressão pET28a. A proteína de fusão foi expressa em duas cepas de E. coli, BL21 Star e C43, em duas temperaturas, 30°C e 37°C. Após 4 horas de indução com IPTG 1 mM, a combinação BL21 Star e 30°C foi a que apresentou a melhor eficiência de expressão. A maior proporção da proteína foi obtida solúvel após purificação por cromatografia de afinidade, como também após a digestão com TEV. A proteína de fusão foi verificada por Western Blotting, utilizando anticorpo anti-MBP.
